从微观上说，系统内能是构成系统的所有分子无规则运动动能、分子间相互作用势能、分子内部以及原子核内部各种形式能量的总和。后面两项在大多物理过程中不变，因此一般只需要考虑前两项，二者的总和就是通常所指的内能。但在涉及电子的激发、电离的物理过程中或发生化学反应时分子内部（不包括原子核内部）的能量会大幅变化，此时内能中必须考虑分子内部的能量。核内部能量仅在核物理过程中才会变化，因此绝大多数情形下，都不需要考虑这一部分的能量。内能的绝对量（主要是其中的核内部能量部分）还不完全清楚，但不影响解决一般问题，对于内能我们常常关心的是其变化量。
抛开物质内部的结构细节，从宏观上说，内能是与系统在绝热条件下做功量相联系的，描述系统本身能量的一种状态函数。内能的宏观定义式为：ΔU=Wa，其中ΔU为内能的变化量，Wa为绝热过程外界对系统的做功量。在宏观定义中，内能是一个相对量。
内能是物体、系统的一种固有属性，即一切物体或系统都具有内能，不依赖于外界是否存在、外界是否对系统有影响。
内能是一种广延量（或容量性质），即其它因素不变时，内能的大小与物质的数量（物质的量或质量）成正比。
内能是系统的一种状态函数（简称态函数），即内能可以表达为系统的某些状态参量（例如压强、体积等）的某种特定的函数，函数的具体形式取决于具体的物质系统（具体地说，取决于物态方程）。当系统处于某一平衡态时，系统的一切状态参量会取得定值，内能作为这些状态参量的特定函数也会取得定值（尽管还不清楚它的绝对数值是多少）。
当系统发生某一变化，从原先的平衡态过渡到另一个新的平衡态时，内能的变化量仅取决于变化前后的系统状态，而与这个变化是如何发生的（例如变化的快慢）以及变化经历了怎样曲折的过程（例如是经历一个等温过程、等压过程还是一个任意过程）完全无关。内能的这一性质和功、热量有着本质的区别。
功和热量都是系统与外界之间交换的能量，或者说系统（从外界）吸收或放出（给外界）的能量。一旦系统对外界做了功或传了热，这部分能量就不再是系统的能量（即不再是系统内能的一部分），而是变成外界物体的能量（构成外界物体内能或动能的一部分）。系统只存在或含有内能（内能的存在不依赖于外界），不存在热量或功（离开外界和系统的相互作用，谈不上热量和功）。仅当系统在外界（外力或温差）的作用下，系统内能中的一部分以功或热量这两种能量形式传给外界（或反之）。功和热量的大小，不仅取决于系统变化前后的状态，还取决于变化的每一细节过程。
对于一定量物质构成的系统，通过做功、热传递与外界交换能量，引起系统状态变化，而导致内能改变，其间的关系由热力学第一定律给出。对于不存在宏观动能变化的系统，ΔU=W+Q，其中ΔU为内能的变化量，W为外界对系统的做功量，Q为系统（从外界）的吸热量。该式称为热力学第一定律的常用表达式内能的概念建立在焦耳等人大量精密的热功当量实验的基础之上。能量和内能概念的建立标志着能量转化与守恒定律（即热力学第一定律）的真正确立。
正如重力对一定质量物体做功的大小与物体下降的路径无关，仅与物体下降前后的垂直位置有关，焦耳的实验证明系统在绝热条件下的做功量与系统经历的具体过程无关，仅与系统做功前后的状态有关。从前一现象人们提出了重力势能的概念，把过程量功表达为仅取决于高度的势能函数在不同高度的函数值之差。类似可以定义一个仅取决于系统状态的函数，把过程量绝热功表为该函数在不同状态的函数值之差。这个被定义的函数，就称为内能。